慶大霉素快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物慶大霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗慶大霉素抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物慶大霉素的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物慶大霉素的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度： 0.05ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～15min
u 樣本檢測下限
組織 ············································ | 2.5 ppb | |
肝臟 | ·············································· | 3 ppb |
牛奶 | ·············································· | 3 ppb |
u 交叉反應率
慶大霉素 | ······································ | 100% |
鏈霉素 | ······································· | <1% |
雙氫鏈霉素 ········································ | <1% | |
新霉素 | ·········································· | <1% |
u 樣本回收率
組織 ······································ 90%±20%
肝臟 ······································ 80%±20%
牛奶 ······································· 90%±18%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | |
標準液×6 瓶 | 0ppb | 0.05ppb | |
2 | 0.15ppb | 0.45ppb | |
（1ml/瓶） | |||
1.35ppb | 4.05ppb | ||
3 | 酶標記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 |
5 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X 濃縮洗滌液 | 15ml | 白色帽 |
9 | 樣本復溶液 | 50ml | 透明帽 |
10 | 10x 濃縮提取液 | 50ml | 藍色帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、
多道 30～300 µl
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
u 樣本前處理需配制：配液 1 樣本提取液：
將 10X 濃縮提取液用去離子水按 1：9 稀釋。
u 樣本處理：
（a）組織（雞肉、豬肉、魚肉、蝦）、肝臟（雞肝、豬肝）樣本處理方法
1、取 1±0.05g 去除脂肪的粉碎樣本，加入 5ml 樣本提取液，振蕩 3min；4000r/min，室溫離心
10min；2、取 50µl 上清液，加入 450µl 樣本復溶液混勻，
混合 30s；3、取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：50
（b） 牛奶樣本處理方法
1、取 0.5ml 均質的牛奶樣本，加入 2ml 樣本提取
液，振蕩 2min；4000r/min，室溫離心 5min；2、取 50µl 上清液，加入 450µl 樣本復溶液混勻，
混合 30s；3、取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：50
六、酶標免疫分析程序:
u 測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫
（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。
3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～
25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放
入自封袋，保存于 2-8℃。
3、配液：將 15ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份
去離子水），或按所需用量配制洗滌液。4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每
個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標準品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物 50µl/孔，然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應 30min。
6、將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。
8、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內讀數(shù)），測定每孔 OD 值。
七、結果判定
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含慶大霉素量成負相關。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：
0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816；0.15ppb 為 1.415； 0.45ppb 為 0.74；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155。則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2
的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即
B
百分吸光率（%）＝ ×100%
B0
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以慶大霉素標
準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
八、 注意事項
1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～
25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4、反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質。
8、該試劑盒理想反應溫度為 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。
2、保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
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