禽流感病毒（H5N1）抗體檢測試劑盒
介紹
禽流感病毒(H5N1)抗體檢測試劑盒檢測雞血清中的禽流感病毒H5N1抗體，用于評(píng)估養(yǎng)雞場雞禽流感疫苗免疫狀況及感染雞的血清學(xué)輔助診斷。
本試劑盒采用間接ELISA法，在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被禽流感H5N1抗原。在試驗(yàn)中，加入稀釋后的待檢血清，經(jīng)過溫育后，若樣品中含有禽流感H5N1特異性抗體，則與包被板上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后；加入酶標(biāo)二抗，與檢測板上的抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物；在微孔中加入TMB底物液，經(jīng)酶催化形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀450nm波長測定反應(yīng)孔中的吸光度A值。
需自備的設(shè)備及試劑
1. 微量移液器： 0.5µl～10µl、10µl～100µl、100µl～1000µl。
2. 一次性移液器吸頭。
3. 量筒：500ml。
4. 96孔板酶標(biāo)儀。
5. 蒸餾水或去離子水。
6. 洗瓶或洗板機(jī)。
樣品制備
取動(dòng)物全血，按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無溶血。
洗滌液的準(zhǔn)備
濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，如有鹽結(jié)晶，搖動(dòng)使結(jié)晶的鹽溶解，然后用蒸餾水或去離子水作10倍稀釋。稀釋好的洗滌液可在4℃存放一周左右。
樣品的稀釋
在血清稀釋板中按1：101的體積比稀釋待檢血清（例如：200μl樣品稀釋液中加2μl待檢血清）。
注意：陰性和陽性對照不用稀釋。取每個(gè)樣品后都要更換吸頭，準(zhǔn)確記錄每個(gè)樣品在板上的位置。每個(gè)樣品在加入到包被板微孔前應(yīng)充分混勻。
注意事項(xiàng)
1. 試劑盒使用前各試劑應(yīng)平衡至室溫，使用前應(yīng)搖勻，使用后放回2～8℃。
2. 不同品種、不同批號(hào)試劑盒的試劑組分不得混用，使用試劑時(shí)應(yīng)防止試劑污染。
3. 底物和終止液對皮膚和眼可能有刺激性，使用時(shí)應(yīng)該注意防護(hù)。
4. TMB（底物B液）不要暴露于強(qiáng)光和避免接觸氧化劑。
5. 檢測板拆封后應(yīng)避免受潮或沾水(未用完的抗原包被板加干燥劑放于自封袋中，并盡快置于2～8℃)。
6. 所有廢棄物在丟棄之前應(yīng)合理處理以免污染。
7. 嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)和洗滌等的全部過程必須精確。
8. 血清稀釋板為一次性用品，不得重復(fù)使用；血清稀釋板的最大容量為300μl/孔。
操作步驟
1. 取預(yù)包被的檢測板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），將稀釋好的待檢血清取100μl加入到檢測板孔中。同時(shí)設(shè)陰性、陽性及空白對照各1孔，取陰性及陽性對照各100μl
分別加入反應(yīng)孔中，空白對照僅加入100μl樣本稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出）。
2. 蓋上封板膜，置37℃溫育30分鐘。
3. 小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗3次。每次用洗滌液注滿板孔（約350μl），靜置1分鐘后甩掉。洗滌3次后在干凈吸水紙上拍干。
4. 每孔加酶結(jié)合物100μl，蓋上封板膜，置37℃溫育30分鐘。
5. 小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗滌3次, 方法同2。切記最后在干凈吸水紙上拍干。
6. 每孔先加底物A液50µl、再加底物B液50µl，混勻、蓋上封板膜37℃閉光顯色10分鐘。
7. 每孔加終止液50μl，使反應(yīng)終止，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。
結(jié)果判定
以空白對照調(diào)零用酶標(biāo)儀于450nm（630nm作參比波長）讀取吸光度A值。試驗(yàn)成立的條件是陽性對照孔A450值大于或等于0.5，陰性對照孔A450值必須小于0.15。如果試驗(yàn)無效，試驗(yàn)中的操作值得懷疑，試驗(yàn)應(yīng)重做，并仔細(xì)檢察各組分。
樣品A450值大于0.15+陰性對照孔均值，判為陽性；樣品A450值小于0.15+陰性對照孔均值，判為陰性；如陰性對照孔均值小于0.05按0.05計(jì)算。
有效期
貯存方法： 2 - 8ºC下貯存。
有效期： 12個(gè)月。
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