EF20A\J2 2016-01版
己烯雌酚
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物己烯雌酚將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物己烯雌酚的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度： 0.1ppb
u 孵育溫度： 37℃
u 孵育時間： 30min～30min～15min
u 樣本檢測下限
組織（蝦、魚） ······························· 0.2 ppb
豬肉/肝 雞肉/肝 ······························· 2 ppb
肌肉組織(方法二) ··························· 0.1 ppb
飼 料 ············································ 20ppb
尿 液 ··········································· 0.6ppb
u 交叉反應(yīng)率
己烯雌酚 ········································ 100%
雙烯雌酚 ········································ 38.5%
己烷雌酚 ········································ 8.5%
己炔雌二醇 ··································· ﹤0.1%
雌三醇 ········································· ﹤0.1%
u 樣本回收率
飼 料 ·········································· 90±10%
組 織 ·········································· 85±10%
尿 液 ·········································· 70±10%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
2 | 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.1ppb |
0.3ppb | 0.9ppb | ||
2.7ppb | 8.1ppb | ||
3 | 酶標(biāo)記物 | 12ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍(lán)色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 5X濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙腈、氫氧化鈉、氯仿、丙酮、濃磷酸（含量85%）、乙酸乙酯
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
u 樣本前處理需配制：
配液1 6M H3PO4 溶液
100ml 濃H3PO4（含量85%）加去離子水150ml混合均勻。
配液2 2M NaOH溶液
8gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液3 1M NaOH溶液
4gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液4 乙腈-丙酮混合液
V乙腈-V丙酮 = 4 : 1
配液5 樣本復(fù)溶液：
將5X濃縮復(fù)溶液用去離子水1：4稀釋。
u 樣本處理：
（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)處理方法
1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，震蕩2min，15℃，4000r/min以上，離心10min。
2、 取3ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干。
3、 加入0.5ml氯仿，渦動20s，加入2ml 2M NaOH，渦動30s，4000r/min以上，離心5min。
4、 取1ml上清液，加入200µl 6M H3PO4，渦動5s。
5、 加入3ml乙腈萃取，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min，取上層有機(jī)相， 60℃氮氣/空氣吹干。
6、 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混勻30s。
不同樣本按如下方法稀釋：
1、 蝦魚：直接取50µl水相用于檢測。
2、 豬肉/肝、雞肉/肝：取50µl水相加入450µl樣本復(fù)溶液，渦動混合30s；取50µl用于檢測。
樣本的稀釋倍數(shù)：
蝦魚稀釋倍數(shù)：2
豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：20
（b）肌肉組織處理方法二
1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入2ml 2M NaOH溶液，震蕩2min；
2、 加入8ml乙酸乙酯，劇烈震蕩5min ；
3、 15℃，4000r/min以上，離心10min；
4、 取4ml上層有機(jī)相， 60℃氮氣/空氣吹干；
5、 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混勻30s。
樣本稀釋倍數(shù)：1
（c）飼料處理方法
1、 稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振搖2min，15℃ 4000r/min以上離心10min；
2、 取2ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干；
3、 加入0.5ml氯仿，渦動20s，加入2ml 1M NaOH，渦動30s，4000r/min以上，離心5min；
4、 取1ml上清液，加入100µl 6M H3PO4，渦動5s；
不同樣本按如下方法稀釋：
1、 配合料：取50µl，加入950µl樣本復(fù)溶液，渦動混勻30s，取50µl 用于檢測。
2、 濃縮料/預(yù)混料：取25µl，加入975µl樣本復(fù)溶液，渦動混勻30s，取50µl 用于檢測。
樣本稀釋倍數(shù)：
配合料稀釋倍數(shù)：100
濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù)：200
（d） 尿樣樣本處理方法
1、 取2ml尿液到離心管中，室溫4000r/min以上，離心10min，直至清亮；
2、 移取1ml清亮尿液至離心管中，加入1ml 1M NaOH強(qiáng)烈振蕩5min；
3、 加入100µl 6M H3PO4，渦動30 s；
4、 再加入8ml氯仿進(jìn)行萃取，振蕩5min。15℃，4000r/min以上離心10min；
5、 去掉上層的水相，取下層有機(jī)相4 ml，60℃氮氣/空氣吹干；
6、 用3ml樣本復(fù)溶液干燥的殘留物，混合30s
7、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：6
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
u 測定前應(yīng)須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min。
9、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含己烯雌酚量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）
八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
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