酵母RNA提取試劑盒( DNase I )說(shuō)明書
RNApure Yeast Kit ( DNase I )
Cat. No. K0629
保存：Lyticase、DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃
其它組分：室溫
組分說(shuō)明
Catalog no. K0629
Kit Size 50
DNase I 1000 U
10×Reaction Buffer 1000 μl
Buffer RL 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2（concentrate） 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Lyticase Working Buffer 30 ml
Lyticase 300 μl
Spin Column RM 50
Collection Tube（1.5 ml） 50
Collection Tube（2 ml） 50
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒用于常見的各種真菌的總 RNA 的快速提取。既可以提取液體培養(yǎng)物，也可以直接提取固體培養(yǎng)基上的真菌菌落。操作簡(jiǎn)單快捷，單個(gè)樣本 30 分鐘內(nèi)可以完成提取全過(guò)程，所提 RNA 純度高，OD260/280一般都在 2.0 左右。提取的 RNA
適用于 RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern Blot 、cDNA 合成等實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1. 預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1） 使用無(wú)RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2） 玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3） 配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水。
4） 操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要勤換手套。
2. 樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)影響RNA提取的的量和質(zhì)量。對(duì)于有些細(xì)胞壁較厚以及在培養(yǎng)階段會(huì)產(chǎn)生大量代謝物的酵母，最好在生長(zhǎng)的早期就收集樣品。
3. 使用前請(qǐng)檢查Buffer RL是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，可置于56℃水浴重新溶解。Buffer RL在使用前請(qǐng)加入β-巰基乙醇，至終濃度為1%。如1 ml Buffer RL加10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer RL室溫可保存1個(gè)月。
4. Lyticase Working Buffer在使用之前應(yīng)加入β-巰基乙醇，1 ml的Lyticase Working Buffer加入10 μl的β-巰基乙醇，加入β-巰基乙醇的Lyticase Working Buffer可以在室溫下儲(chǔ)存1個(gè)月。
5. 第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明先在Buffer RW2中加入無(wú)水乙醇。
自備試劑：β-巰基乙醇、無(wú)水乙醇（新開封或提取RNA專用）、70%乙醇（用無(wú)RNase的水配制）
操作步驟
1. 取約1-5 ml 酵母培養(yǎng)物，12,000 rpm（~13,400×g）離心1分鐘，盡量吸取全部上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。
注意：酵母培養(yǎng)物最多不超過(guò)3×107個(gè)細(xì)胞，一般對(duì)于釀酒酵母OD600值為1.0時(shí)，相當(dāng)于1-2×107細(xì)胞/ml。
2. 酵母細(xì)胞壁的去除：向菌體中加入600 μl Lyticase Working Buffer（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇，使其終濃度為1%）,并加入5μl Lyticase（10 U/μl），充分混勻，并在搖床上220 rpm/min，30℃處理30分鐘。4,000 rpm（~1,500×g）離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。
注意：以上為3×107 個(gè)酵母細(xì)胞Lyticase用量，根據(jù)酵母的菌株和酵母細(xì)胞數(shù)量的不同，所用的Lyticase的濃度和孵育時(shí)間應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
3. 向沉淀中加入350 μl Buffer RL（使用前加入終濃度為1%的β-巰基乙醇）反復(fù)吹打幾次，使其充分裂解。如果有可見不溶物，最大轉(zhuǎn)速離心2分鐘，取上清進(jìn)行下一步。
注意：盡量使細(xì)胞充分懸浮并充分裂解否則影響RNA產(chǎn)量。
4. 向步驟3所得到的溶液中加入1倍體積（350 μl）的70%乙醇（RNase-Free Water配制），混勻。
5. 將步驟 4 所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm 離心 15 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入。
6. 向吸附柱中加入 350 μl Buffer RW1，10,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
7. 配制 DNase I 混合液：取 52 μl RNase-Free Water，向其中加入 8 μl 10 × Reation Buffer 和 20 μl DNase I（1U/μl），混勻， 配制成終體積為 80 μl 的反應(yīng)液。
8. 向吸附柱中直接加入 80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育 15 分鐘。
9. 向吸附柱中加入 350 μl Buffer RW1, 12,000 rpm 離心 15 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入 500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無(wú)水乙醇）,12,000 rpm 離心 15 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
11. 重復(fù)步驟 10。
12. 12,000 rpm 離心 2 分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR 等）。
13. 將吸附柱置于一個(gè)新的無(wú) RNase 離心管（Collection Tube 1.5 ml），向吸附柱的中間部位懸空加入 30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置 1 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘，收集 RNA 溶液，-70℃保存。
注意：1）RNase-Free Water 體積不應(yīng)小于 30 μl，體積過(guò)小影響回收率。
2）如果要提高 RNA 的產(chǎn)量，可用 30-50 μl 新的 RNase-Free Water 重復(fù)步驟 10。
3）如果要提高 RNA 濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟 10。
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